Elektroforeza jest jednym z najczęściej używanych narzędzi w biologii molekularnej. Służy do oddzielania kwasów nukleinowych. Elektroporacja to proces, w którym kwas nukleinowy jest rozdzielany na podstawie wielkości. W elektroforezie stosuje się żel. W żelu wykonuje się dołki, do których ładowane są próbki kwasu nukleinowego. Przepływa prąd elektryczny i na podstawie wielkości kwasu nukleinowego porusza się w żelu. Pomaga określić ilościowo, oddzielić i oczyścić kwas nukleinowy.
Agaroza kontra poliakrylamid
Różnica między agarozą a poliakrylamidem polega na tym, że agarozę stosuje się do oddzielania dużych fragmentów DNA, ale żel poliakrylamidowy służy do oddzielania krótszych fragmentów białka i kwasu nukleinowego. Agarozę wlewa się poziomo, natomiast poliakrylamid wlewa się pionowo. Agarozę można podgrzewać i przelewać poziomo, ale łatwo się łamie, dlatego należy się z nią obchodzić ostrożnie.
Żel agarozowy jest najczęściej używany do prowadzenia elektroforezy. Ponieważ pomaga oddzielić kwas nukleinowy na podstawie wielkości, jest on używany do identyfikacji nieznanej próbki DNA lub RNA. Tutaj stosuje się drabinę o znanej wielkości i prążek nieznanego nukleinu porównuje się z drabiną i identyfikuje się rozmiar.
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym nazywa się PAGE. Jest powszechnie używany do rozdzielania białek na podstawie ich wielkości. Ta elektroforeza działa w oparciu o zasadę, że naładowane białko lub próbka kwasu nukleinowego migruje przez żel pod wpływem pola elektrycznego. Ponieważ ruchliwość cząsteczki biologicznej zmienia się w zależności od wielkości i ładunku. Użytą próbkę należy poddać obróbce w celu uzyskania jednolitego ładunku, tak aby mobilność zależała zasadniczo od rozmiaru.
Tabela porównawcza między agarozą a poliakrylamidem
| Parametry porównania | Agaroza | Poliakrylamid |
| Toksyczność | Nietoksyczny | Lekko toksyczny |
| Rozmiar porów | Większe pory | Mniejsze pory |
| Zastosowania | Żel agarozowy służy głównie do oddzielania DNA i RNA | Żel poliakrylamidowy służy do oddzielania białka i jego ilościowej oceny |
| Pozycja do nalewania żelu | Pozycja pozioma | Pozycja pionowa |
| Barwnik | Bromek etydyny | Błękit bromofenolowy |
| Ponowne użycie | Agarozę można stopić i wykorzystać ponownie | Zwykle nie jest ponownie używany |
Co to jest agaroza?
Agaroza to biocząsteczka, która służy do tworzenia żelu będącego trójwymiarową matrycą z porami i kanałami. Trójwymiarowa matryca jest utrzymywana razem przez wiązania wodorowe. Ponieważ istnieją wiązania wodorowe, strukturę matrycy można łatwo denaturować przez ogrzewanie. Próbki biocząsteczek poruszają się przez pory.
Temperatura topnienia agaru wynosi 85-95 stopni Celsjusza, a temperatura żelowania 35-42 stopni Celsjusza. Żel agarozowy powstaje poprzez zmieszanie agarozy z wodą i stopienie jej. Następnie wylewa się go poziomo na formę, w której umieszcza się grzebień. Agaroza następnie schładza się i tworzy żel. Grzebień pozostawia dołek, w którym można umieścić próbkę.
Żel agarozowy o niskim stężeniu jest podatny na pękanie. Dlatego należy obchodzić się z nim ostrożnie. Do oddzielenia DNA i RNA można użyć agarozy. Pory w żelu agarozowym są znacznie większe, aby mógł wniknąć bakteriofag. Agaroza to polimer z grupami pirogronianowymi i siarczanowymi. Ponieważ grupy te są naładowane ujemnie, powoduje to przepływ wody w kierunku przeciwnym do ruchu DNA.
Barwnik bromek etydyny służy do barwienia DNA, co zmienia wielkość i ładunek próbki. Do zestawu wlewa się roztwór buforowy i przepływa prąd, co powoduje, że próbka przechodzi przez żel agarozowy i tworzy pasma.
Co to jest poliakrylamid?
Poliakrylamid to syntetyczny polimer liniowy składający się z akrylamidu i kwasu akrylowego. Poliakrylamid aktywnie wchłania wodę i tworzy miękki żel. Jest jednym z żeli stosowanych w elektroforezie. Białko i kwas nukleinowy można oznaczać ilościowo w żelu poliakrylamidowym na podstawie ich ruchliwości elektroforetycznej.
Żel poliakrylamidowy wytwarzany przez uwodnienie akryloamidu jest dobry, ponieważ wielkość porów można regulować w zależności od uwodnienia. Żel o małych porach jest skuteczny w badaniu cząsteczek o mniejszych rozmiarach. Większe cząsteczki nie mogą poruszać się przez małe pory i zostać uwięzione, podczas gdy mniejsze cząsteczki łatwo poruszają się przez pory i tworzą pasma.
Żel poliakrylamidowy jest najczęściej używany w eksperymencie SDS PAGE. SDS PAGE rozszerza się podczas elektroforezy w żelu siarczanu dodecylu sodu-poliakryloamidu. Służy do rozdzielania próbek białek na podstawie ich wielkości. Dodecylosiarczan sodu jest detergentem i wiąże się z cząsteczką białka. Po związaniu się z białkiem ten detergent niszczy drugorzędową i trzeciorzędową strukturę białka i przekształca je w liniowy łańcuch polipeptydowy. Ten liniowy polipeptyd jest naładowany ujemnie i przemieszcza się w kierunku anody pod wpływem pola elektrycznego. Tutaj odległość przebyta przez cząsteczkę jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu masy cząsteczkowej. Służy również do badania próbek kwasów nukleinowych o niskiej masie cząsteczkowej.
Główne różnice między agarozą a poliakrylamidem
Wniosek
Agaroza i poliakrylamid to dwa różne polimery. Są chemicznie różne. Chociaż oba są używane do elektroforezy, są używane do dwóch różnych celów. Agaroza ma większe pory i służy do oddzielania większych cząsteczek kwasu nukleinowego, takich jak DNA i RNA. Z drugiej strony poliakrylamid ma mniejsze pory i jest używany do oddzielania i oznaczania ilościowego białek o mniejszej masie cząsteczkowej.
Oba te związki służą różnym celom i są bardzo przydatne w biologii molekularnej. Oprócz biologii molekularnej znajdują zastosowanie również w wielu innych dziedzinach. Ponieważ te żele pomagają w ilościowej ocenie kwasu nukleinowego i białka, mają zastosowanie w medycynie i kryminalistyce.
